外泌體是細胞外囊泡的一種亞型，后者是源自細胞的脂質(zhì)雙層閉合結(jié)構(gòu)，幾乎由所有類型的細胞分泌，包括外泌體（30-150 nm）、微泡（150 nm 至 1 μm）和凋亡小體（1-5 μm）。長期以來，這些囊泡被認為是一種裝載細胞代謝廢物的方式，負責運輸細胞產(chǎn)生的廢物。直到80年代，科研人員在研究綿羊網(wǎng)織紅細胞的發(fā)育時，才初步確定了一些30-150 nm的囊泡的作用，并命名為外泌體。在電子顯微鏡下觀察，外泌體的形狀一般呈杯狀或球狀，其在細胞間保護和遞送功能性大分子，包括核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物，將它們的“貨物”轉(zhuǎn)移到受體細胞。
基于多年的研究，行業(yè)已經(jīng)認識到了外泌體在多種應用中的潛力。在目前的臨床試驗中，外泌體被用作生物標志物、無細胞療法（外泌體療法）、藥物遞送系統(tǒng)以及抗腫瘤疫苗等。其來源包括間充質(zhì)細胞、T 細胞和樹突狀細胞以及其它工程細胞系。
外泌體作為藥物遞送載體具有不可替代的優(yōu)勢，包括低免疫原性、優(yōu)異的生物相容性和生物穩(wěn)定性。除了使用未經(jīng)任何基因/化學修飾的天然外泌體外，對于將有效載荷載入外泌體，主要有兩種方式：在直接方法中，外泌體在制備和純化后裝載治療藥物（外源性加載），而在間接方法中，適當?shù)募毎?jīng)過基因工程處理或與治療藥物共培養(yǎng)以產(chǎn)生工程外泌體（內(nèi)源性加載）。
對于外源性加載，行業(yè)已經(jīng)探索了各種策略，以將藥物加載到外泌體中，最大化其遞送潛力，包括簡單的孵育以及電轉(zhuǎn)、超聲處理、凍融等。研究之間通常存在一些差異，歸因于不同的親本細胞的生物學行為和試劑特性。此外，外泌體天生就裝載有天然蛋白質(zhì)和核酸，這大大降低了所需的載荷裝載效率。實現(xiàn)最佳裝載的正確方法，又在一定程度上取決于載荷分子，必須事先仔細選擇，并且應該考慮負載能力、藥物保留和對外泌體特性的潛在影響。直接加載策略的局限性限制了基于外泌體的療法在臨床試驗中的使用。
創(chuàng)建和使用合理且目的性設計、具有高度定義和可再現(xiàn)屬性、同時具有一個已知作用機制的工程外泌體是天然源性外泌體的一個令人信服的替代選擇，因為天然源性外泌體通常具有較高的異質(zhì)性，且作用機制不明確，而工程外泌體對于重要新藥物的開發(fā)來說，是更加可行的基礎。但工程方法需要在維持理想的外泌體理化特性和提高裝載效率方面實現(xiàn)一定的改進。而另一個挑戰(zhàn)在于，大部分用于外泌體工程的方法都難以在穩(wěn)定載入所需載荷以及表面修飾 vs. 保持外泌體生物相容性之間找到平衡。
在將基于外泌體的療法擴展到工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)并隨后進入臨床的另一個瓶頸是大規(guī)模臨床級外泌體的產(chǎn)生。外泌體的產(chǎn)量高度依賴于其親本細胞，受限于細胞分泌外泌體的能力不同以及大規(guī)模細胞培養(yǎng)的高難度和高成本。對于藥用外泌體行業(yè)，擴大到工業(yè)水平仍處于起步階段，最重要的是盡早決定能夠生產(chǎn)所需數(shù)量并含有治療性有效載荷的外泌體的方法。
大規(guī)模外泌體分離方法的低效性是臨床級外泌體開發(fā)的另一個障礙。不同細胞類型釋放的外泌體的數(shù)量、物理化學特征和組成可能不同。目前，基于不同原理的技術(shù)已用于外泌體分離，包括差速/超速離心、過濾、尺寸排阻層析、基于免疫親和捕獲、聚合物沉淀等。盡管已經(jīng)開發(fā)并優(yōu)化了一些外泌體純化方法，但仍然很難找到一種特定的方法解決所有相關的挑戰(zhàn)，如分離效率低、樣品損失、外泌體回收率和純度低、以及批次間差異。相應地，全面表征外泌體也至關重要，特別是在大小、形態(tài)、濃度、外泌體標記物/內(nèi)容物的存在以及污染物的去除方面。
分離技術(shù) | 原理 | 優(yōu)點 | 缺點 |
基于差速/超速離心的技術(shù) | 基于密度和粒徑的順序分離 | 外泌體分離的金標準，大樣本處理量 | 耗時長，且受操作者的影響，啟動量大，設備成本高，并且外泌體可能會因高速離心而受損 |
超濾 | 粒徑 | 操作簡單快捷，便攜性好，可放大性高 | 剪切力、外泌體進入濾膜的阻塞和捕獲導致的潛在外泌體降解和溶解(從而導致外泌體丟失) |
尺寸排阻層析 | 粒徑 | 高純度的外泌體，重力流保留了外泌體的結(jié)構(gòu)、完整性和生物活性(不受剪切應力影響)，具有良好的可重復性 | 耗時長，設備成本適中，需要專用設備，難以規(guī)模放大 |
流場-流分餾 | 粒徑 | 溫和的分離，由于沒有剪切力，允許緩沖交換，在分離的外泌體亞群具有潛在治療應用時尤其重要。 | 在進一步研究之前可能需要額外的預濃縮步驟，樣本量低，難以擴大規(guī)模 |
基于微流的技術(shù) | 免疫親和、粒徑和密度 | 高效率，快速樣品處理，高便攜性，易于自動化和集成 | 需要大量的起始材料以提高產(chǎn)率，較低的樣品處理量 |
免疫親和捕獲 | 基于使用特異性外泌體標記物的外泌體捕獲 | 獲得高特異性和純度的外泌體 | 試劑成本高，收率低，使用受限 |
沉淀 | 溶解性和分散性 | 使用方便，不需要專門的設備，樣本量大，可擴展。 | 缺乏特異性、選擇性和低純度(其它非外泌體污染物，如蛋白質(zhì)和聚合物材料可能會共沉淀) |
雖然仍存在挑戰(zhàn)和限制，但各種制藥公司和初創(chuàng)企業(yè)已經(jīng)鋪平了臨床級外泌體療法的發(fā)展之路。越來越多的公司專注于開發(fā)此類基于外泌體的療法，以解決各種療法的藥物輸送問題，包括小分子、RNA 療法、蛋白質(zhì)、病毒基因療法，甚至成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列 (CRISPR) 基因編輯工具。其中一些公司也在尋求更加創(chuàng)新的外泌體工程方法來設計基于外泌體的治療藥物，以增加載藥量，提高靶向能力。
遞送 RNA、蛋白質(zhì)和化學藥物的傳統(tǒng)方法已經(jīng)顯示出一些局限性，而外泌體作為藥物遞送載體具有免疫原性低、長期安全和無細胞毒性等巨大優(yōu)勢，在基于外泌體的藥物在臨床轉(zhuǎn)化、大規(guī)模生產(chǎn)、穩(wěn)定的制備、存儲方案和質(zhì)量控制方面仍存在必須克服的挑戰(zhàn)。進一步開發(fā)細胞衍生的工程外泌體及其分離、純化和藥物裝載技術(shù)將有助于克服這些缺點。工程外泌體在提高生產(chǎn)力方面具有顯著的商業(yè)優(yōu)勢。此外，通過將特定的表面分子錨定在外泌體上，可以增加外泌體在靶細胞或目標疾病部位的局部濃度，從而降低毒性和不良反應，并最大限度地提高治療效果。未來，行業(yè)將可能開發(fā)新型多功能化工程外泌體來改善醫(yī)療保健，因此，需要進一步的研究來探索外泌體介導療法的新策略。
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